Всеукраинская ассоциация озонотерапевтов

Конторщикова К.Н., Ведунова М.В., Радаева М.В., Королева Е.Ф.
Нижегородская государственная медицинская академия,

г. Нижний Новгород, Россия

Метаболический синдром (МС) является  одной из самых изучаемых патологий в мире, так как от осложнений, связанных с развитием данного заболевания, ежегодно погибает более шести миллионов человек. По современным представлениям метаболический синдром (МС) характеризуется как совокупность нарушений системной, в том числе, гормональной регуляции углеводного, жирового, белкового и других видов обмена веществ под действием внешних и внутренних факторов [1].  Критериями метаболического являются: висцеральное ожирение (главный критерий); гипертриглицеридемия; гипоальфалипопротеидемия; артериальная гипертензия; глюкоза сыворотки крови  натощак выше 5,6 мМ/л либо установленный диагноз сахарного диабета (СД) 2-го типа. В связи с этим для диагностики МС необходимо присутствие главного и любых двух дополнительных критериев [2-5]. Именно комплексное понимание МС дает возможность выявления патогенеза и прогнозирования развития данной патологии.

При МС отмечается накопление в крови патологически высоких концентраций продуктов липидного и углеводного обмена, промежуточных метаболитов и аномальных соединений, таких как окисленные липопротеины, гликозилированные белки, продукты жизнедеятельности гипоксических тканей.

Особый вклад в эндогенную интоксикацию организма вносят продукты окислительной деструкции биомолекул. В связи с этим активность антиоксидантной системы, как части гомеостатической регуляции интоксикации, имеет особое значение для течения и характера проявлений заболевания.

Одним из биологически активных агентов, стимулирующих детоксицирующую и антиоксидантную системы организма, является озон. Физиологический эффект озона реализуется посредством влияния на клеточные мембраны и заключается в нормализации уровня продуктов окисления и антиоксидантной защиты.

В связи с этим целью нашей работы является оценка активности детоксицирующих и антиоксидантных систем организма при коррекции малыми дозами озона метаболических нарушений у больных с метаболическим синдромом.

Исследования проводились в крови больных метаболическим синдромом. В анализируемую группу вошло  65 человек в возрасте от 50 до 70 лет. Контролем служила кровь 23 практически здоровых лиц. При обследовании больных с метаболическим синдромом для оценки степени метаболических изменений и осложнений, вызванных развитием заболевания, использовалась специально разработанная клиницистами числовая система, позволяющая оценить вклад различных нозологических форм в совокупную клиническую картину конкретного больного. По трех- бальной шкале оценивались степень выраженности СД II, гипертонии, атеросклероза, ожирения, сопутствующих заболеваний. Числовая форма диагноза являлась суммой бальной оценки, осуществляемой  лечащим врачом.

Определение биохимических показателей проводилось до и сразу после окончания курса лечения, который включал в себя внутривенное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 300 – 400 мкг/л. Для оценки изменения метаболического статуса организма все исследования больных проводились до и после курса лечения.

Биохимические исследования включали изучение показателей липидного и углеводного обмена (общий холестерин, триглицериды, ароВ,  ХС-липопротеинов низкой плотности, коэффициент атерогенности, глюкоза).

Активность глутатион-S-трансферазы определяли по изменению количества кофермента, регистрируемому при 340 нм (Варбург). Изучение уровня окислительной модификации белков проводили по методу Дубининой (1995). В крови больных оценивали показатели перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах. Активность свободнорадикальных процессов оценивалась методом индуцированной  хемилюминесценции (Кузьмина, 1983). При этом анализ хемилюминограммы  проводили по параметрам I_max; S; tg -2?. Содержание первичных продуктов – диеновых конъюгатов (ДК), вторичных – триеновых  конъюгатов (ТК) и конечных продуктов ПОЛ – оснований Шиффа (ОШ) определяли спектрофотометрически по методу Волчегорского (1989) в модификации. Уровень антиоксидантной защиты оценивали по активности ферментов супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГЛР) с помощью унифицированных тест-систем фирмы RANDOX (Англия).

Уровень и стадию эндогенной интоксикации определяли по количеству веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) (модификация метода Малаховой, 1977) [6]. У больных выявлены следующие стадии эндогенной интоксикации: первая стадия, характеризующаяся элиминацией токсинов за счет их переноса и частичной детоксикацией эритроцитами; вторая стадия – фаза накопления токсичных продуктов, связанная с насыщением эритроцитов и появлением эндотоксинов в плазме; третья стадия, фаза полного насыщения, при которой наблюдается максимальная концентрация патологических веществ как в плазме, так и в эритроцитах;  четвертая стадия, в которой  количество токсинов в плазме  продолжает нарастать, а в эритроцитах, значительно потерявших транспортный и детоксикационный потенциал, падает. При этом в исследуемую группу вошло 10,77% больных (7 человек) с первой стадией интоксикации, 61,54% (40 человек) со второй, 16,92% (11человек) с третьей стадией и 10,77% (7человек) с четвертой. Распределение больных по стадиям интоксикации представлено  в таблице 1.

Согласно полученным данным количество ВНСММ в эритроцитах и плазме больных МС достоверно выше, чем в крови практически здоровых людей (р<0,05) (табл.1).

 Таблица 1

Исследование показателей липидного обмена продемонстрировало значительное увеличение уровня общего холестерина у 77% больных (50 человек) более, чем на 25%, и составило 7,72 ± 1,07 ммоль/л  при желательном уровне до 5,2 ммоль/л. Значительное повышение уровня триглицеридов наблюдалось у 41% больных (27 человек) в среднем на 62% от рекомендуемых значений и составил 2,76 ± 0,885 ммоль/л. Увеличение коэффициента атерогенности до 4,35 ± 0,45 (норма 3) наблюдалось у 83% (53 человека). Уровень глюкозы натощак превысил значение 5,6 ммоль/л у 58% (38 человек) обследованных и составил в среднем 10,25 ± 4,52 ммоль/л.

Степень эндогенной интоксикации больных с диагностированным СД II оказалась значительно выше, что свидетельствует о том, что СД II является одним из основных отягощающих факторов неблагоприятного течения метаболического синдрома.

Уровень ВНСММ плазмы крови в большей степени зависел от количества триглицеридов (коэффициент корреляции 0,578). Величина КЭН (коэффициент эндогенной нагрузки) зависел от количества общего холестерина, ХС-липопротеинов низкой плотности, апоВ (коэффициенты корреляции 0,547, 0,586 и 0,774, соответственно). Кроме того, у 54% больных значительно повышена скорость оседания эритроцитов (СОЭ). СОЭ является одним из основных показателей воспалительных процессов. В данном случае воспаление связано с реакциями, характерными для метаболического синдрома. Возможно, что повышение СОЭ обусловлено накоплением в крови окисленных липопротеинов, которые, являясь антигенами, активируют макрофагальное звено иммунитета. Показано влияние величины  СОЭ на уровень ВНСММ плазмы крови и КЭН (коэффициент корреляции 0,643 и 0,524, соответственно).

Таблица 2
Изменение показателей  интоксикации при коррекции метаболических

нарушений озоном

После курса озонотерапии наблюдалось снижение уровня ВНСММ в плазме на 22%, а в эритроцитах на 28%. Кроме того, отмечалось перераспределение пула ВНСММ между плазмой и эритроцитами, что является важным критерием стадии эндогенной интоксикации. Коэффициент расчета эндогенной интоксикации (КРЭИ) характеризует отношение плазматического и эритроцитарного пула ВНСММ. Снижение КРЭИ от 0,724 до 0,536, наряду с уменьшением ВНСММ и в плазме и в эритроцитах, является прогностическим признаком, поскольку основная детоксицирующая система крови локализована в эритроцитах.

 Активность глутатион-S-трансферазы в эритроцитах после курса лечения повышалась на 31,5% от 25,33 ± 0,43 ммоль/мин·л Hb. Увеличение активности фермента не связаны с количественными изменениями, так как зрелые эритроциты не обладают способностью к полноценному белковому синтезу. При этом активность плазматической фракции фермента либо снижалась, либо оставалась статистически неименной. После курса  озонотерапии в крови наблюдалось достоверное снижение количества модифицированных белков при всех исследуемых длинах волн (356 нм, 363 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм) у большинства больных. Снижение составляло в среднем 12,5% относительно исходного уровня. У 23% больных наблюдалось снижение только ОМБ, регистрируемой при длине волны 356 нм, 363 нм и 370 нм.

Таблица 3
Уровни продуктов ПОЛ в плазме и эритроцитах  до и после озонотерапии

Таблица 4
Показатели свободнорадикального окисления  в плазме и эритроцитах больных до и после озонотерапии

* -достоверность различий по сравнению с исходным показателем ( р< 0,05 )

Уровень I_max имел тенденцию к снижению  как в плазме, так и в эритроцитах. Показатель S, характеризующий суммарную антиоксидантную активность в плазме, оставался без изменений, тогда как в эритроцитах  достоверно снижался, свидетельствуя о повышении антиоксидантной активности. Показатель tg -2?, также характеризующий антиоксидантную активность, имел тенденцию к улучшению и в эритроцитах, и в плазме.

Уровни молекулярных продуктов перекисного окисления липидов как первичных (ДК, ТК), так и конечных (ОШ) имели тенденцию к постепенному снижению в плазме. В эритроцитах содержание ДК достоверно снизилось в 2 раза; ТК – в 1,5 раза; ОШ – в 2 раза.

Таблица 5
Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах до и после озонотерапии

* - достоверность различий по сравнению с исходным показателем ( р<0,05)

Активность ферментов, измеряемая в эритроцитах, показала, что имеет место повышение активности СОД, сдерживающей начальные стадии свободнорадикальных реакций. Падение активности ферментов ГПО и ГЛР, по всей видимости, связано со снижением уровней первичных молекулярных продуктов  липопероксидации (ДК, ТК), являющихся субстратом, регулирующим активность данных ферментов.

Выводы: проведенные нами исследования свидетельствует об активации детоксицирующих и антиоксидантных систем организма под влиянием малых доз озона. Снижение ВНСММ при метаболическом синдроме является благоприятным прогностическим признаком и согласуется с изменениями в показателях липидного обмена. Снижение ОМБ свидетельствует о том, что применяемые дозы озона не оказывают повреждающего эффекта на белки организма. Увеличение активности глутатион-S-трансферазы, СОД, снижение показателя S хемилюминограммы указывают на значительную роль эритроцитарных детоксицирующих и антиоксидантных систем в снятии токсической нагрузки организма при коррекции метаболических нарушений озоном.

Список литературы
1.                 Беляков Н.А., Чубриева С.Ю., Глухов Н.В., и др. Метаболический синдром у женщин (патофизиология и клиника) СПб.-2005.

2.                 Строев Ю.И., Цой Л.П., Чурилов Л.П., Шишкин А.Н. Классические и современные представления о метаболическом синдроме. Часть 1. Критерии, эпидемиология, этиология //Вестник Санкт-Петербургского университета.-2007.-Сер.11, Вып 1.С 3-15

3.                 Kahn R., Buse J., Ferrannini E., Stern M., The metabolic syndrom: time for critical appraisal: Joint statement of ADA and EASD // Diabetologia. 2005. Vol. 48.P. 1684-1699.
4.                 International Diabetes Federation // Promoting diabetes care, Prevention and a cure woridwide definition of the metabolic syndrom. P.1-7.
5.                 Метаболический синдром /под ред. Ройтберг. Медпресс.-М.2007, 233 с.

6.                 Копытова Т.В., Абалихина Е.П., Щелчкова Н.А. Значение определения липидов в биологических субстратах для оценки обменных процессов при псориазе // Клиническая лабораторная диагностика, № 11, 2007, С 20-23.

Буряк И.А., Зинченко В.Д, Зинченко А.В., Семенченко А.Ю., Воловельская Е.Л.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины

г. Харьков, Украина,

В настоящее время накоплено достаточно много данных о воздействии озона на клетки крови. В работах [5, 2] указывается, что под влиянием озона меняется текучесть мембран и детергентоустойчивость эритроцитов. По данным [7], обработка крови пациентов озоном вызывает повышение текучести липидов эритроцитарных мембран, повышение деформируемости и фильтруемости эритроцитов, что способствует улучшению их кислородтранспортной функции. При этом обработка крови терапевтическими дозами озона (10 – 40 мг/мл газа на 1 мл крови) не приводит к возрастанию перекисного окисления мембранных липидов. Эти результаты указывают на то, что эритроциты цельной крови защищены различными плазменными антиоксидантами. Однако после обработки озоном эритроцитов, отмытых от плазмы солевыми растворами, обнаруживается снижение их деформируемости и фильтруемости [7].

Таким образом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о неоднозначности действия озона на эритроциты, причем молекулярные механизмы биологического действия озона до конца не ясны.

Цель данной работы - исследовать действие озона на термостабильность гемоглобина и мембраносвязанных белков эритроцитов. Исследования проводили  методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на приборе ДАСМ-4 (Пущино, СКББП).

Эритроциты выделяли из донорской крови человека, полученной на Харьковской областной станции переливания крови. Для этого их трижды отмывали от плазмы физиологическим раствором (0,15 М NaCl), центрифугируя при 800 g в течение 10 минут. Мембраны и гемоглобин получали путем осмотического лизиса эритроцитов [4].
Озон для исследований получали из газообразного кислорода производства Харьковского кислородного завода (ГОСТ 5583-78) кислорода на озонаторе безбарьерного типа. Физиологический раствор во флаконах объемом 50 – 200 мл барботировали озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 30 мг/л при потоке 2 л/мин. Различные дозы озона вводили в исследуемые образцы путем добавления озонированного физиологического раствора с требуемыми концентрациями озона. Концентрацию озона в растворе определяли по величине экстинкции на длине волны 255 нм на спектрофотометре Specord UV VIS.
Применяли два способа воздействия озона на мембраны и гемоглобин эритроцитов. Озоном обрабатывали цельные клетки, из которых затем выделяли гемоглобин и тени для калориметрических исследований, или изолированные мембраны и гемоглобин, предварительно выделенные из эритромассы.

Анализ полученных термограмм показал, что дестабилизирующее действие озонана молекулы изолированного гемоглобина начинает проявляться при дозе озона 5,93 г О₃ /моль Нb, что соответствует конечной концентрации озона0.8 мг /л раствора гемоглобина. Форма термограмм денатурации гемоглобина при высоких дозах озона – 26,9 г О₃ /моль Нb (4,3 мгО₃/л раствора)и 38,7 г О₃ /моль Нb (6 мгО₃/л раствора) дает основание для предположения о разрыхлении молекул гемоглобина. На это указывает уширение пиков денатурации. Монотонный рост  полуширины пиков плавления гемоглобина при повышении дозы озона можно объяснить также увеличением вклада метгемоглобина.

Форма пика термоденатурации гемоглобина, полученного из озонированных эритроцитов, при дозе озона 9 мгО₃ /л также свидетельствует о разрыхлении молекул гемоглобина, однако изменения формы пика выражены в меньщей степени, чем при озонировании белка в изолированном состоянии. 

При обработке теней дозой озона 0,13 мгО₃/г белка, что соответствует 0,2 мгО₃/л суспензии теней, регистрируются 4 перехода - А, B, C, D, - характерные для теней эритроцитов [1; 6; 3]. Повышение дозы озона более 1,23 мг О₃/г белка (2 мгО₃/л суспензии теней) приводит к снижению интенсивности пиков, соответствующих указанным выше переходам, и при дозе 5,29 мг О₃/г белка (7,4 мг/л суспензии) эндотермические пики, соответствующие переходам А и D выражены слабо, в то время как переходы В и С не регистрируются. Полученные результаты позволяют сделать вывод о полной денатурации белков, плавление которых соответствуют пикам В и С, под действием озона в результате окислительной деструкции. На термограммах теней, полученных из озонированных эритроцитов (0,2 мгО₃/л суспензии), переходы не отличаются от таковых на термограммах теней эритроцитов, не подвергавшихся озонированию. При увеличении дозы озона до 9 мгО₃/л суспензии интенсивность пиков плавления снижается, однако наличие всех переходов указывает на сохранение соответствующих мембраносвязанных белков.
Таким образом, установлено, что при озонировании гемоглобина и мембран в изолированном виде наиболее подверженными действию озона являются белки, плавление которых соответствует пикам В и С на термограммах. При озонировании цельных клеток гемоглобин и тени эритроцитов обнаруживают более высокую термоустойчивость, чем при их озонировании в изолированном виде. Данный эффект, по нашему мнению, может объясняться защитным действием антиоксидантных систем эритроцитов. Однако при высоких дозах озона компенсаторные возможности антиоксидантных систем исчерпываются, целостность мембран нарушается, и внутриклеточный гемоглобин становится доступным для озона.

Литература
1.                  Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Степуро И.И. Термостабильность эритроцитарных мембран в присутствии этанола // Биофизика. – 1994. – Т. 39, №3. – С. 470 – 475

2.                  Калер Г.В., Рачковский Л.И., Матус В.К., Конев С.В. Влияние озона на устойчивость эритроцитов к действию детергентов // Биологические мембраны, 1990. Т. 7, №1. – С. 41 – 46

3.                  Матвеев А.В., Акоев В.Р., Тараховский Ю.С., Деев А.А., Брюханов В.М., Жадан Г.Г., Шныров В.Л. Сравнительное исследование структурных переходов в эритроцитарных мембранах доноров и новорожденных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1997. – Т. 123, № 2. – С. 196 – 200

4.                  Fairbanks G., Steck T.L., Mallach D.F. Electroforetic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. – 1971. – Vol. 10, №12. – P. 2606 - 2617
5.                  Gornicki A., Gutsze A. In vitro effects of ozone on human erythrocyte membranes: an EPR study // Acta Biochimica Polonica. – 2000. - Vol. 47, № 4. – P. 963 – 971
6.                  Snow J.W., Vincentelli J., Brandts J.F. A relationship between anion transport and a structural transition of the human erythrocyte membrane // Biochim. Biophys. Acta. – 1981. – Vol. 642, № 3. – P. 418 – 428
7.                  Travagli V., Zanardi I., Silvietti A., Bocci V. A physicochemical investigation on the effects of ozone on blood // Intern. Journ. Biol. Macromol. – 2007. – Vol. 41, Issue 5 – P. 504-511

Мартусевич А. К.^1,2, Норенкова Н. В.¹, Киселева Ю. А.², Квицинская Н. А.¹, Лузан А. С.¹, Пронина Н. В.^2
1 ФГУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Росмедтехнологий», Нижний Новгород, Россия